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Diseño de radiotrazadores PET
Introducción
El desarrollo de la producción de trazadores marcados con 11C, 18F, 13N 15O designados para uso en investigaciones biológicas no-invasivas, se requiere establecer una metodología detallada y congruente1. Una ventaja de los núclidos de radiación Gamma, es la de monitorearse in-vivo por detección externa. En los primeros reportes de investigación de este tipo, se recomendó hacer uso del Geiger-Muller2 para observar el destino del trazador marcado3.
El mismo concepto ha sido refinado y desarrollado con la técnica de tomografía por emisión de positrones (PET) (siglas en ingles), donde los datos obtenidos a partir de medidas de radioactividad son usados por una computadora para obtener imágenes4. Tipos similares de imágenes son también utilizados en otras técnicas (SPECT5, CT6 y MRI7), donde MRI Y CT son especialmente usados para obtener información detallada de estructuras morfológicas. Las técnicas PET y SPECT, por otro lado, brindan imágenes con burda resolución espacial, pero tienen como ventaja el poder obtener información concerniente a procesos fisiológicos y bioquímicos8. El área de aplicación más valiosa para el PET no es la producción de la imagen en sí misma, sino la posibilidad de medir la concentración in vivo en función del tiempo.
Un importante aspecto de la técnica del PET es la vida media corta de la emisión positrón de los nuclidos (11C, 15O, 18F y 13N) usados para marcar trazadores.
Existen tres razones por las que estos núclidos son elegidos:
El decaimiento por emisión de positrones, resultando en dos fotones gamma antiparalelos, es un prerrequisito para el plan de detección especial y métodos de computación empleados en la reconstrucción de imágenes.
La vida media corta (2-110 minutos) minimiza la dosis de radioactividad dada al sujeto y permite repetir estudios.
La alta radioactividad específica obtenible permite el uso de pequeñas cantidades de sustancias marcadas, así se minimizan los problemas del proceso estudiado.
Con la excepción de 18F en el caso de sustancias endógenas, en el marcaje con estos radionuclidos no se aprecian cambios en las propiedades biológicas del trazador.
La disciplina científica que se enfrenta con la producción de trazadores para PET es una aplicación de la química orgánica, modulada por las demandas impuestas por los radionuclidos usados. Este campo, la química orgánica radiofarmaceutica, esta también matizado por las opiniones de los científicos utilizando las metodologías del PET. Así, las teorías biológicas tienen una marcada influencia sobre como son diseñados los trazadores del PET. La producción de los trazadores es facilitada en gran parte por métodos especialmente diseñados, donde la automatización es de particular importancia. Los marcajes resultan interesantes para investigaciones primarias en estudios cerebrales, y regiones específicas del cuerpo.
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Diseño de trazadores PET
Una de las características de la técnica PET consiste en las ricas posibilidades que ofrece el uso de diferentes trazadores9 (15) y las diferentes preparaciones de los estudios del sujeto, para extraer cierta información biológica10 (8). Además de la selección de la estructura química, la posición del marcaje puede buscarse para obtener un trazador específico para el proceso que se va a estudiar11 (16).
Los tipos de sustancias que son particularmente interesantes como candidatos a trazadores pueden ser divididas en tres categorías:
Sustancias endógenas (aminoácidos, neurotransmisores, hormonas)
Fármacos (Drogas Psicofarmacologicas)
Sustancias desarrolladas especialmente para medidas fisiológicas (Agentes para determinar regionalmente el flujo de sangre, flujo de volumen, pH, etc.)10 (8).
La mayor distinción de entre estas sustancias es determinada por factores tales como la obtención en el órgano de interés, la selectividad con que se toma en cuenta el proceso en estudio y la medida en la cual el trazador refleja la información de interés.
Precursores Marcados
La síntesis de los trazadores marcados con 11C inicia con la producción de un “precursor primario” por el bombardeo de nitrógeno con protones de alta energía (14N(p,a)11C)21 (30). El “precursor primario” más común, [11C] dióxido de carbono, es obtenido si las trazas de oxigeno son añadidas hacia el nitrógeno usado. El precursor primario puede ser usado directamente para marcar la molécula del blanco, pero es usualmente transformado en un “precursor secundario” antes de la reacción con un sustrato apropiado. El término, “precursor marcado” es usado para denotar intermediarios sintéticos marcados con 11C, ejemplificados en el esquema siguiente.22, 23 (15a, 31).
El desarrollo de nuevos precursores secundarios es importante, ambos para el marcaje de nuevos tipos de sustancias y para incrementar el número de posiciones de marcaje potenciales. La utilidad del marcaje de intermediarios sintéticos esta relacionada con el siguiente número de factores:
· El tiempo de síntesis a partir de la producción del precursor primario.
· La pureza radioquímica y la radiactividad especifica.
· La pureza química, y / o el tipo de sustancias concomitantes.
· La versatilidad del grupo funcional (o grupos).
· La conveniencia y la fiabilidad del método de producción.
Las sustancias volátiles que pueden transportarse con una corriente de gas y atrapadas dentro de un líquido, son importantes en este contexto. La razón es que la transferencia pueda lograrse rápidamente y que la purificación pueda realizarse por destilación y bajo el control del cromatógrafo de gases24 (32). El valor de los intermediarios sintéticos con alto punto de ebullición, por otro lado, puede incrementarse por la elaboración de una sola ruta de procedimientos.
Elección del radionúclido
Los radionuclidos mas comúnmente usados para marcar trazadores PET son 15O, 13N, 11C y 18F, (con una vida media de 2.1, 10.0, 20.3 y 109.7 minutos respectivamente). Un criterio importante para escoger el radionuclido es que la vida media debe corresponder con el tiempo de ventana del proceso biológico que será estudiado.Un estado seguro de medidas de extracción de oxigeno por ejemplo, son convenientemente interpretadas usando [15O] Oxigeno, mientras que los trazadores marcados con 18F, son útiles para estudios de procesos lentos (síntesis de proteínas)12 (17). De cualquier modo, estas son dos ventajas en el uso de 15O, 13N ó 11C en comparación con 18F.
Los compuestos que contienen fluoruro son raramente encontrados en personas o animales, y la sustitución de fluoruro puede cambiar radicalmente las propiedades biológicas de los compuestos marcados13 (18). La corta vida del 15O, 13N ó 11C permite usar más de un trazador en sucesión sobre el mismo sujeto. Esta posibilidad, denota “protocolos de multitrazadores” puede proveer importantes contribuciones en el desarrollo de la metodología PET. Los radionuclidos 15O, 13N ó 11C, mencionados anteriormente son usados frecuentemente para la síntesis de trazadores por las siguientes razones:
Desde hace mucho se conoce que el carbón forma parte de todos los compuestos orgánicos, el uso potencial de 11C, desde el punto de vista tanto de su síntesis como de su aplicación es ilimitada. La ventana de tiempo dada por la vida media del 11C es apropiada para amplios espectros en procesos biológicos. La vida media del 11C es suficientemente larga para permitir realizar múltiples procedimientos en las etapas sintéticos de la vía metabólica.
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Posición de marcaje
En todas las aplicaciones donde se asume que el trazador puede experimentar cambios metabólicos durante el tiempo de la investigación, la posición del marcaje es importante. Por ejemplo, cuando se usa 11C-glucosa marcada uniformemente, solo los datos obtenidos en las etapas tempranas del experimento PET, pueden ser considerados como útiles. La razón es que todos los productos catabólicos de la glucosa serán marcados, dando un aumento en la difusión en el trazador metabólico que es difícil de describir por medio de los modelos14 (19).
Un dilema similar se origina cuando el [18F]-fluoro deoxi glucosa es usado. En este caso, la posición de marcaje es específica, pero debido a la estructura deoxi, el metabolismo del trazador es inhibido después de la etapa de fosforilación15 (20). En contraste, usando 11C-glucosa marcada específicamente en la posición 1 y 6 respectivamente, es posible obtener información acerca de las diferentes etapas del metabolismo de la glucosa y distinguir entre estas rutas16 (21,22). Otro ejemplo ilustrativo del uso del marcado en posición especifica, marcando en diferentes posiciones, es la aplicación de 11C-DOPA en estudios de actividad de neurotransmisores en la actividad cerebral17 (22). Dependiendo de la posición, el marcaje terminará como dióxido de carbono ó dopamina como resultado de la transformación bioquímica ocurrida en el cerebro. La radiactividad en la forma de dióxido de carbono es rápidamente eliminada del tejido cerebral y no tiene unión específica.
La radiactividad en la forma de dopamina por otro lado, se mantiene más tiempo dentro del tejido cerebral y se une de manera específica a los receptores dopaminérgicos. De acuerdo con esto, la dinámica de las medidas de radiactividad y la distribución del marcaje el cual puede ser diferente para dos diferentes trazadores. Esta observación refleja la actividad de la enzima: Aminoácido aromático descarboxilasa.
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Síntesis de compuestos marcados con 11C
La síntesis de compuestos marcados con radionuclidos de vida media corta, como 11C, difieren considerablemente de síntesis orgánicas ordinarias por la vida media corta, la radioactividad y las pequeñas cantidades de las sustancias marcadas. Estas diferencias aparecen como restricciones, pero son ventajas. Por ejemplo, por medidas de radiactividad, los rendimientos pueden determinarse rápidamente y la producción de la sustancia marcada puede ser una ruta fácil durante la transferencia del proceso de purificación.
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Precursor primario
Por nuestra definición es el compuesto directamente producido en el blanco o el producto el cual puede obtenerse a partir de cada compuesto por una rápida sobre línea de síntesis. Ejemplos de precursores 11CO2, 11CO, H11CN y 11CH4
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Precursores secundarios
Definidos como el producto que puede obtenerse a partir de los precursores primarios en la producción de partida. Estos precursores son muy importantes como material sintético de partida. Ejemplos de precursores secundarios R-11CH2I,
R-11CHO, R-11CO2H y R-11CH2OH.
En la síntesis del marcaje de compuestos, tienen que examinarse cuidadosamente las limitaciones del rango de precursores primarios y secundarios disponibles. Esto es importante para la selección, como estrategia sintética requerida para el marcaje de compuestos. Así tienen que considerarse factores con actividad especifica, la posición del marcaje y la configuración estereo especifica. Las etapas de síntesis tienen que envolverse con reacciones químicas las cuales ocurran rápidamente y con altos rendimientos. Los problemas que mayor se presentan son: la rutina de producción de los radiofarmacos, y el manejo de altos niveles de radiactividad. Tienen también que considerarse otros problemas concernientes a la reproducibilidad de la síntesis, aislamiento de producto marcado, pureza radioquímica, esterilidad y pirogenicidad de la solución radiofarmaceutica. Los aparatos de reacción tienen que diseñarse y construirse antes de terminar la preparación de la síntesis. La influencia de los disolventes, temperatura, catálisis, concentraciones de sustrato, etc., tienen que investigarse cuidadosamente. En el orden de optimizar la estrategia de la síntesis envuelta en varias etapas, seleccionada para compuestos deseados, es necesaria una optimización multidimensional. Esto envuelve el tiempo de optimización para la síntesis (ST)34 (3), el rendimiento químico y recuperación del proceso.
Aspectos de tiempo
Debido a la vida media tan corta del 11C (20.3 minutos) el tiempo es un factor importante en la optimización del rendimiento radioquímico del trazador marcado con este radionuclido. Una regla es que la producción (radionuclido al trazador inyectable) debe realizarse dentro de las tres vidas medias. El valor de la vida media puede también usarse para calcular tiempos óptimos en etapas individuales de reacción. Esto puede darse usando datos de las medidas de reacciones cinéticas junto con la función de decaimiento radiactivo en expresiones de rendimiento radioquímico y en función de tiempo absoluto18 (27). Por ejemplo, incrementar el tiempo de reacción 5 minutos no tiene utilidad si el rendimiento químico solo incrementa del 60 al 70%, así durante este tiempo la contribución del decaimiento el rendimiento decrece al 11%.
Como consecuencia de la restricción del tiempo, los métodos sintéticos son frecuentemente modificados cuando se usan en la producción de trazadores. Por ejemplo, las reacciones en condiciones drásticas dan un bajo rendimiento químico en síntesis ordinarias, pueden usarse en procedimientos de marcaje si el incremento en la velocidad de reacción es lo suficientemente largo. El principio de optimización de tiempo también influye en la elección de un grupo protector y / o el tipo de procedimiento usado para la síntesis y el trabajo. Como ejemplos están el uso de un fondo de procedimientos, ultrasonidos19 (28) o microondas20 (29), con el fin de reducir el tiempo de producción simplificando el manejo técnico y/o incrementando los valores de la reacción. El factor más importante en la producción rápida de trazadores es, de cualquier modo la pequeña cantidad de la sustancia marcada. Esto permite reacciones más rápidas, al igual que las transferencias y purificaciones del trazador.
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Automatización
Para proteger al químico de la radiación, la síntesis de marcaje tiene que llevarse fuera, atrás del blindaje de plomo, y preferentemente por control remoto o automatización. La automatización puede afectarse básicamente en dos formas. Una es por el uso de robots, los cuales son capaces de transferir soluciones y / o mover objetos27 (35). La otra es transferir gases o líquidos por medio de tubos, usando diferencias de presión y sistema de válvulas28 (36). Cuando es emplea la mecánica como estado del arte en estos sistemas, junto con la regulación de una computadora, los procedimientos sintéticos complejos pueden hacerse con una alta exactitud y reproducibilidad.
Un prerrequisito para desarrollar la metodología de trazadores PET es acceder a un largo número de diferentes trazadores que puedan producirse dentro de un intervalo de tiempo muy corto. En este contexto es benéfico, si la automatización se diseña observando una máxima versatilidad, y si los accesorios en el procedimiento de marcaje no necesitan una organización individual. La síntesis de algunos trazadores se formulan de tal manera, para acoplarse a un modulo de producción o estación multi-tareas29 (37). Cuando se desarrolla alguna síntesis de 11C, es prudente considerar aspectos de automatización en la planeación. Así, deben preferirse las reacciones que pueden afectarse por métodos compatibles con las facilidades de automatización.
Radioactividad especifica
La radiactividad especifica teórica para 11C, es 3.4 x 105 GBq / mmol. De cualquier modo, por dilución isotópica durante la producción del radionuclido, dentro de los sistemas de química y por los reactivos químicos, el valor práctico para el marcaje de trazadores es usualmente en un rango de 1 – 100 GBq / mmol. Como consecuencia de esta dilución, la actividad especifica de los trazadores marcados podrán relacionarse tanto la cantidad inicial de radioactividad producida como el total del tiempo de síntesis.
No obstante la dilución isotópica de la cantidad del trazador marcado (usualmente 10-8 – 10-6 mol) es lo suficientemente pequeña para permitir el uso de sustancias con alta actividad farmacológica sin afectar al sistema biológico estudiado25 (33). Para la mayoría de los trazadores presentados en este trabajo, la alta actividad específica es menos importante desde que las concentraciones in vivo de estas sustancias, son relativamente altas.
Análisis e identificación
Debido a restricciones de tiempo límite y a las pequeñas cantidades de sustancias, los métodos cromatográficos como TLC, CG y HPLC, son los más convenientes para el análisis de marcaje de compuestos con 11C.
La fase reversiva HPLC, es el método más comúnmente usado debido a su aplicabilidad general. Equipada con un detector para radiación y un detector de masas (Absorción UV), el HPLC se usa para la identificación por co-elusión de la muestra con una referencia caracterizada. Los procedimientos de derivación se valoran para las confirmaciones de identidad estereoquimica30 (38) y grupos funcionales31 (39) y para facilitar la detección. Con la llegada de los radio-detectores sensibles para gas, los capilares del CG tienden o llegan a ser de fácil complemento del HPLC para el análisis de compuestos marcados con 11C. La electroforesis capilar es otro método desarrollado para radio-análisis32 (40). La técnica ha sido exitosamente aplicada para la identificación de proteínas marcadas con 11C32 (40).
Por interfase de instrumentos LC y GC con un detector MS, el valor de estos métodos para propósitos de identificación tiene un marcado incremento, no solo se obtiene información concerniente al peso molecular y la estructura, sino también la sensibilidad de detección. La espectroscopia 13C-NMR puede usarse para estimar la posición del marcaje. Esto se logra al correr la correspondiente síntesis de 13C concomitantemente con la síntesis de 11C seguido de un análisis de 13C NMR. Se efectúa un análisis LC del producto radiactivo para mostrar que la adición transportadora no cambia la reacción misma. El producto puede analizarse por NMR también cuando se usa un transportador no modificado33 (41).
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DISEÑO DE RADIOTRAZADORES PET